熒光免疫測定技術的概念

1 、熒光免疫測定技術的概念：將試劑抗原或試劑抗體用熒光素進行標記，試劑與標本中相應的抗體或抗原反應后，測定復合物中的熒光素，這種免疫技術，稱為免疫熒光素技術。

2、熒光的產生：

  物質吸收外界能量而進入激發狀態，在回復基態時多余的能量以電磁輻射的形式釋放，即發光，這種光稱為熒光。這種物質，稱為熒光素。         

  由光激發所引起的熒光，為光致熒光

                            ------熒光免疫技術       

  由化學反應所引起的熒光，為化學熒光

                            ------化學發光技術

3、熒光素的熒光特性：

⑴ 停止供能，熒光現象隨即終止

⑵ 對光的吸收和熒光的發射具高度選擇性,綠色熒光選藍色為激發光，紅色熒光選綠色為激發光

      入射光波長<發射光波長

⑶ 熒光效率：           發射熒光的光量子數

          熒光效率=----------------------------

                            吸收光的光量子數

⑷ 熒光猝滅現象：熒光素的輻射能力減弱

常見熒光素的特性：

  ⑴ FITC：黃色結晶粉末，吸收光（藍色激發光）：490~495nm，

          發射光：520~530nm，明亮的黃綠色熒光。

4、熒光亮度的判斷標準：一般為四級，即“—”無或可見微弱自發熒光。“+”僅能見明確可見的熒光。“++”可見有明亮的熒光。“+++”可見耀眼的熒光。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上，而各種對照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性。

5、普通熒光顯微鏡的操作指南

（1）關閉房間內的電燈，開啟顯微鏡汞燈。為延長汞燈的使用壽命，汞燈開啟不到15-30分鐘的請在15-30分鐘后關閉汞燈。再次打開汞燈電源的間隔時間也應該在15-30分鐘以上，避免反復開關。

（2）根據樣品熒光素選擇相應熒光組件。使用減光片對熒光強度適當調整（因為熒光強度不可調，所以只能使用各種減光片來調整觀察效果）

（3）選擇濾光片。常用的有綠、藍、紫、紫外等，分別對應不同的激發光波長。

（4）放好染色切片，找到合適的視野。在熒光狀態下觀察標本，標本內的熒光會較快的衰減，所以要避免長時間的在熒光下觀察，可以先在明場下調整好要觀察的位置再使用熒光。

（5）需拍照先確認照相機已裝好。

（6）使用結束關閉所有電源并做好使用記錄。

（7）如需詳細說明，請借閱說明書。

操作流程（S_ABC- FITC）三步發光法

細胞爬片

蓋玻片的處理：先用洗潔精沖洗干凈（用大號的培養皿，將玻片平鋪在上面，把洗潔精弄出泡泡，放在水平搖床上搖30min~60min）→用自來水沖洗干凈（先放在水上沖，再加上自來水在搖床上搖約30min×3次）→將濃硫酸加入培養皿中，泡酸24 h→自來水沖洗干凈→ddH₂O沖洗30~50min×3次→放入60℃烤箱烤干→用紗布將玻片平攤開來，隔層包裹→置于飯盒中高溫高壓消毒

↓

細胞長滿，0.25%胰酶消化，細胞計數，接種至6孔板，每孔約3ml細胞懸液，加完后在邊上輕輕吹幾下，十字形晃動數次，保證細胞在蓋玻片上均勻覆蓋。（注意：1、預實驗時，摸一個的細胞量，一般3~5×10⁵為宜；2、先在每個孔里準備放爬片的位置滴少量培養基，目的是使玻片與培養皿靠培養基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細胞懸液時玻片漂起，造成雙層細胞貼片。3、整個過程注意無菌操作。）

↓

培養24h，待細胞接近60%~70%匯合

↓

取出六孔板，浸入0.01MPBS，約3ml/孔，于搖床上搖5min×3次

↓

固定：

4%多聚甲醛固定30min（室溫），約2ml/孔

↓

棄干凈液體，（用吸管在邊緣處輕輕吹打幾次）浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次

↓

破膜：

加0.1%TritonX-100，20min，室溫，約2ml/孔

↓

棄干凈液體，（用吸管在邊緣處輕輕吹打幾次）浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次

↓

消除非特異性反應：

浸入0.75%H₂O₂，在37℃作用30min(配方：1ml30%H₂O₂+39ml 0.01M PBS,現用現配，避光保存)

↓

棄干凈液體，浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次

↓

以下操作均在濕盒中進行

封閉：

↓

滴加用0.01M PBS1:10稀釋的正常血清封閉液，37℃,30min(注意：150ul/孔；吸去多余的液體，不要洗)

↓

免疫反應：

滴加0.01M PBS按一定比例稀釋的一抗，150ul/孔（稀釋度，一般取推薦濃度的中間值），37℃,30min后，4℃過夜

↓

復溫，室溫放置30~45min,(用or不用37℃放置10~20 min)【一抗孵育，總時長在16~18h】

↓

棄干凈液體，浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次

↓

滴加0.01M PBS 1:100稀釋的生物素化二抗，150ul/孔，37℃,30min

↓

棄干凈液體，浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次

↓

發光：(此操作一定要避光，可以將搖床拿入暗室當中，)

↓

滴加0.01M PBS 1:100稀釋的S_ABC-FITC，150ul/孔，37℃,30min

↓

棄干凈液體，浸入0.01MPBS，5min×3~4次（一定要洗干凈，否則背景會很高）

↓

取玻片時由于玻片與培養皿底結合較緊，張力較大，將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出就可以了

↓

緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察

注意事項：

1、在六孔板間隙的孔中加入0.01M PBS，制成濕盒環境。

2、需設空白對照。從加一抗開始，空白對照組全部用0.01M PBS。

3、熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長 ，會使熒光減弱。

4、需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。

5、所滴加的待檢抗體標本或熒光標記物，應始終保持在已知抗原標本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。

試劑配制：

1、0.01M PBS       1000ml            2000ml         5000ml

   NaCl             8.5g             17.0g          42.5g

   NaH₂PO₄.2H₂O      0.3g               0.6g           1.5g

  Na₂HPO₄.12H₂O      2.9g               5.8g          14.5g

2、0.1%TritonX-100

   TritonX-100       100ul   定容至    常溫保存備用

   0.01M PBS         100ml   100ml

3、4%多聚甲醛

   多聚甲醛         4g         60℃約5min+2滴2mol/L    搖晃 ，定容至100ml

   0.01M PBS        100ml         NaOH助溶 PH=7.2       4℃保存，2周用完

4、0.75% H₂O₂

    30% H₂O₂             1ml                現用現配，

  0.01M PBS        39ml               4℃避光保存